清華新聞網(wǎng)3月12日電 CRISPR/Cas9為遺傳病治療帶來(lái)革命性突破，當(dāng)前其安全性研究多聚焦脫靶引發(fā)的序列改變，往往忽視了對(duì)細(xì)胞表觀(guān)基因組及功能的影響。近日，清華大學(xué)藥學(xué)院李寅青副教授、自動(dòng)化系張學(xué)工教授團(tuán)隊(duì)發(fā)文系統(tǒng)性揭示了CRISPR/Cas9基因編輯的潛在表觀(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)：即便是在遠(yuǎn)離基因調(diào)控元件的非編碼區(qū)進(jìn)行編輯，也會(huì)引發(fā)大范圍的染色質(zhì)擾動(dòng)，尤其可能導(dǎo)致成體干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等干性細(xì)胞丟失自身干性特性，發(fā)生提前分化。團(tuán)隊(duì)還針對(duì)性提出了安全優(yōu)化策略，為基因編輯技術(shù)的安全應(yīng)用提供參考。
人類(lèi)基因組中，編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域僅占不到3%，剩下超97%的非編碼區(qū)并非無(wú)用的DNA，而是分布著大量調(diào)控元件，它們通過(guò)復(fù)雜的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因表達(dá)，維持著細(xì)胞的獨(dú)特身份——比如神經(jīng)干細(xì)胞始終保持干性、持續(xù)分化產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞，就需要這些調(diào)控元件的穩(wěn)定工作。
此前的基因編輯安全研究，大多聚焦在占基因組~3%的編碼區(qū)的脫靶突變，對(duì)非編碼區(qū)的編輯影響少于深入探索。而研究團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼區(qū)的基因編輯，即使切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離調(diào)控元件，也可能引發(fā)連鎖反應(yīng)，這種影響還會(huì)因細(xì)胞類(lèi)型不同產(chǎn)生巨大差異：在已分化的細(xì)胞中，編輯引發(fā)的染色質(zhì)擾動(dòng)范圍較小，僅延伸幾千堿基的距離；但在干性的細(xì)胞中，如小鼠胚胎干細(xì)胞等細(xì)胞中，擾動(dòng)范圍會(huì)放大數(shù)百倍，能延伸至幾十萬(wàn)堿基的距離，在基因組里引起大范圍的調(diào)控改變。
為了定量這種作用，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了PSIchrom擾動(dòng)跨度指數(shù)，能夠根據(jù)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，初步預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì)基因編輯擾動(dòng)的敏感程度。PSIchrom指數(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞、成體干細(xì)胞中評(píng)分很高，也意味著它們是基因編輯中的敏感細(xì)胞，是值得重點(diǎn)關(guān)注的細(xì)胞群體。
引起研究團(tuán)隊(duì)特別關(guān)注的是，這種大范圍的染色質(zhì)擾動(dòng)，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞等干性細(xì)胞的影響尤為顯著。實(shí)驗(yàn)中，研究人員在小鼠海馬體的神經(jīng)干細(xì)胞非編碼區(qū)進(jìn)行基因編輯，即便切割位點(diǎn)距離關(guān)鍵調(diào)控元件幾萬(wàn)堿基的距離，仍觀(guān)察到神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)明顯的提前分化，原本的干性細(xì)胞群體顯著減少，分化出的神經(jīng)母細(xì)胞數(shù)量顯著上升。成體干細(xì)胞作為體內(nèi)組織修復(fù)、再生的起始細(xì)胞，其干性的丟失，可能會(huì)直接影響組織的正常生理功能，這也意味著在基因編輯治療中，干細(xì)胞的這類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。
研究團(tuán)隊(duì)也解析了現(xiàn)象背后的生物學(xué)機(jī)制：干性細(xì)胞與分化細(xì)胞的DNA修復(fù)方式存在巨大差異。分化細(xì)胞主要通過(guò)快速的cNHEJ通路修復(fù)DNA斷裂；但神經(jīng)干細(xì)胞、成體干細(xì)胞等干性細(xì)胞，更傾向于非cNHEJ修復(fù)路徑，可能引發(fā)大規(guī)模的DNA末端切除，形成延伸幾十萬(wàn)堿基長(zhǎng)度的單鏈DNA。這些單鏈DNA可能會(huì)破壞細(xì)胞的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)：一方面讓維持染色質(zhì)架構(gòu)的CTCF蛋白無(wú)法正常結(jié)合DNA，另一方面擾亂染色質(zhì)凝聚體的遠(yuǎn)程調(diào)控作用，最終導(dǎo)致干細(xì)胞的關(guān)鍵干性基因表達(dá)失調(diào)，哪怕沒(méi)有DNA序列的變化，比如大片段的DNA缺失等序列改變，干細(xì)胞也可能會(huì)丟了自己的干性特征，發(fā)生提前分化，失去原本的生理功能。
基因編輯擾動(dòng)基因組并導(dǎo)致干細(xì)胞干性丟失
基于對(duì)風(fēng)險(xiǎn)機(jī)制的清晰解析，研究團(tuán)隊(duì)從編輯設(shè)計(jì)、藥物干預(yù)、工具選擇三個(gè)維度，提出了具有應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)化策略，從源頭減少染色質(zhì)擾動(dòng)，保護(hù)干細(xì)胞的特性：第一，距離感知型sgRNA設(shè)計(jì)：在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)，潛在脫靶位點(diǎn)應(yīng)避開(kāi)與關(guān)鍵調(diào)控元件（如超級(jí)增強(qiáng)子）在三維空間內(nèi)鄰近的位點(diǎn)；第二，小分子藥物干預(yù)：使用抑制劑（如MRN抑制劑）適度抑制ssDNA切除過(guò)程，可在維持一定編輯效率的前提下，顯著縮小染色質(zhì)擾動(dòng)范圍，有效維持干細(xì)胞特性。第三，優(yōu)化工具選擇：相比于Cas9、Cas12a、引導(dǎo)編輯器，堿基編輯在相同位點(diǎn)基本不誘導(dǎo)染色質(zhì)擾動(dòng)，表現(xiàn)出更高的表觀(guān)遺傳安全性。
研究成果以“減少基因組編輯引發(fā)的遠(yuǎn)程染色質(zhì)擾動(dòng)有利于維持干細(xì)胞身份”（Minimizing far-extending chromatin perturbation in genome editing preserves stem cell identity）為題，于3月5日發(fā)表于《細(xì)胞·干細(xì)胞》（Cell Stem Cell）。
清華大學(xué)藥學(xué)院副教授李寅青、自動(dòng)化系教授張學(xué)工，已出站博士后朱明（現(xiàn)為華東師范大學(xué)研究員）為論文共同通訊作者；朱明，清華大學(xué)藥學(xué)院袁俊松博士、孟秋辰博士，2021級(jí)博士生余嘉偉、徐曉慶為論文共同第一作者。
研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)中心、清華大學(xué)自主科研計(jì)劃、高校青年教師科研創(chuàng)新能力支持項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S193459092600038X?sessionid=
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
