清華新聞網(wǎng)3月4日電 泛素化修飾是調(diào)控真核細(xì)胞表觀(guān)遺傳狀態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制之一。核小體組蛋白上特定位點(diǎn)的單泛素化，如H2AK15、H2AK119、H2BK120，在DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄沉默及基因激活等核心生命過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。去泛素化酶（DUBs）則負(fù)責(zé)精準(zhǔn)地移除這些泛素標(biāo)記，其活性在復(fù)雜的天然染色質(zhì)環(huán)境中受到嚴(yán)格調(diào)控。
盡管傳統(tǒng)的泛素活性探針已在去泛素化酶的全局性鑒定與催化機(jī)制解析中廣泛應(yīng)用，但它們面臨一個(gè)關(guān)鍵局限：缺乏真實(shí)的底物環(huán)境。這些探針無(wú)法模擬蛋白質(zhì)所處的天然核小體環(huán)境，也缺乏位點(diǎn)特異性信息，因而難以用于研究依賴(lài)染色質(zhì)環(huán)境的核小體DUBs，限制了我們對(duì)表觀(guān)遺傳調(diào)控深層機(jī)制的探索。
近日，清華大學(xué)藥學(xué)院秦為助理教授課題組、上海交通大學(xué)藥學(xué)院艾華松副教授課題組與清華大學(xué)化學(xué)系劉磊教授課題組合作，創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)了一種基于二硫鍵捕獲機(jī)制的底物導(dǎo)向型核小體去泛素化酶活性探針。這一新型探針巧妙地解決了傳統(tǒng)工具的不足，兼具抗水解穩(wěn)定性與底物環(huán)境特異性，成功實(shí)現(xiàn)了在天然核小體環(huán)境下對(duì)位點(diǎn)特異性去泛素化酶的精準(zhǔn)捕獲與機(jī)制解析，為表觀(guān)遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新型化學(xué)工具。
研究采用“底物模擬?+?二硫鍵捕獲”的設(shè)計(jì)策略：在泛素化組蛋白的異肽鍵結(jié)構(gòu)上引入2,2′-二硫代二吡啶活化的巰基乙基修飾，既模擬天然核小體底物的結(jié)構(gòu)特征，又通過(guò)穩(wěn)定的異肽鍵類(lèi)似物抵抗DUB的水解。當(dāng)DUB的催化半胱氨酸靠近探針時(shí)，發(fā)生特異性二硫鍵交換反應(yīng)，形成共價(jià)復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)靶向捕獲。
SD-NucDUB-ABP捕獲去泛素酶（DUBs）并應(yīng)用于組學(xué)研究和XL-MS的示意圖
這一探針平臺(tái)具有良好的通用性與可拓展性。針對(duì)DNA損傷修復(fù)相關(guān)位點(diǎn)H2AK15Ub，研究團(tuán)隊(duì)合成了H2AK15UbAT核小體探針，在經(jīng)X射線(xiàn)照射的HeLa細(xì)胞核裂解液中篩選并驗(yàn)證USP3為其天然去泛素化酶，并利用交聯(lián)質(zhì)譜（XL-MS）繪制了USP3與核小體、泛素之間的空間互作網(wǎng)絡(luò)。該策略進(jìn)一步拓展至轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)的H2AK119Ub與基因激活相關(guān)的H2BK120Ub位點(diǎn)，分別成功捕獲USP16、Ubp10等特異性DUBs，并證明其適用于完整核小體及H2A-H2B二聚體等多種底物形態(tài)。
研究突破了傳統(tǒng)泛素探針在染色質(zhì)環(huán)境中的應(yīng)用限制，實(shí)現(xiàn)了在核小體底物環(huán)境下對(duì)位點(diǎn)特異性去泛素化酶的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選與機(jī)制解析。該工具可廣泛應(yīng)用于鑒定不同泛素化位點(diǎn)的特異性DUBs，為闡明表觀(guān)遺傳調(diào)控的分子機(jī)制、挖掘疾病相關(guān)靶點(diǎn)提供支持，在腫瘤表觀(guān)遺傳、DNA損傷修復(fù)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。
研究成果以“通過(guò)二硫鍵捕獲法開(kāi)發(fā)底物導(dǎo)向的活性探針用于研究核小體位點(diǎn)特異性的去泛素化”（Development of Substrate-Directed Activity-Based Probes via Disulfide-Trapping for Site-Specific Interrogation of Nucleosomal Deubiquitination）為題，于2月7日發(fā)表于《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》（Journal of the American Chemical Society，JACS）。
上海交通大學(xué)藥學(xué)院副教授艾華松、清華大學(xué)藥學(xué)院助理教授秦為和清華大學(xué)化學(xué)系教授劉磊為論文共同通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院2022級(jí)博士生何藻蓁，藥學(xué)院2023級(jí)博士生霍苑桐和博士后張艷玲為論文第一作者。
艾華松課題組得到國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金、上海市藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及遞送前沿科學(xué)研究基地面上項(xiàng)目、上海交通大學(xué)“2030”C類(lèi)項(xiàng)目等的支持。秦為課題組得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)博士后面上項(xiàng)目、北京市自然科學(xué)基金、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、清華大學(xué)“篤實(shí)計(jì)劃”、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、深圳市醫(yī)學(xué)研究基金等的支持。
論文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c20156?sessionid=
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
